表没食子儿茶素没食子酸酯,表没是食儿酸酯儿茶素中含量最高活性最强的成分,也是茶素绿茶利好人体健康的主要承担者。儿茶素的没食结构特征是B-环上有二个或三个羟基基团和A-环上的5,7-二羟基基团,稳定因此具有抗氧化活性。性研EGCG除上述两个环上的表没羟基外,还在D-环上带有三个羟基,食儿酸酯在四种主要的茶素儿茶素中,其抗氧化活性最强。没食EGCG不仅可以直接清除胞内活性氧/氮离子,稳定还能螯合几种具有强正电荷的性研金属离子;其可使铁离子失活,抑制超氧化物驱动的表没芬顿反应;抑制H2O2形成和脂质过氧化。因此,食儿酸酯大多研究认为EGCG对人体健康的茶素利好效应源于其卓越的抗氧化能力。 然而,由于EGCG特殊的化学结构特征,稳定性较差,可发生自动氧化和异构反应,根据所处条件(EGCG浓度、pH、温度和含氧景等)其反应取向不同。当EGCG自动氧化形成多聚物时,可能产生如H2O2一类的活性氧,表现出促氧化活性。有研究发现,50μmol/LEGCG在无细胞的McCoy’S5A培养基中120min,培养基中的H2O2达到峰值25μmol/L。用相同的条件处理HT-29细胞30min后培养体系中的H2O2水平达到最高水平10μmol/L,在活体中,也观察到了EGCG的促氧化效应,用高剂量的EGCG喂食小鼠,出现剂量依赖的肝脏毒性。但EGCG的促氧化效应在不同的细胞和动物模型中并没有得到一致的结论。Sheng等发现200μmolZL的H202能显著诱导正常人心脏成肌细胞H9c2凋亡,而EGCG可抑制H2O2介导的H9c2凋亡,用EGCG单独处理H9c2时并未观察到胞内外的H2O2水平的变化。 因此,本文解析EGCG氧化聚合的环境条件,及其稳定性变化对受试细胞氧化还原平衡的影响,为进一步探讨EGCG在细胞培养体系及活体中的作用机制奠定基础。 1 材料与方法1.1 材料与仪器人正常结肠上皮NCM460细胞购白中科院昆明动物所细胞库;EGCG粉末购白sigma公司;过氧化氢检测试剂盒(S0038)购白上海碧云天公司。 MCO-5AC培养箱SANYO;318C酶标仪上海三科仪器;NanoPhotometerN60分光光度计IMPLEN;VANOX-S显微镜0TⅣPUS。 1.2 实验方法1.2.1 主要试剂配制1.2.1.1 EGCG溶液0.15gEGCG粉末融人10mL的三蒸水中搅拌均匀配制成32mmol/L的EGCG溶液,在超净T作台利用0.2μm针头滤器进行无菌过滤。待实验丌始前将EGCG溶液储存液稀释至如表1所需浓度。 1.2.1.2 细胞培养基RPMll640或DMEM培养液Gibco,含10%胎牛血清Gibco;0.1%双抗(10万单{ 立/mL)Gibco;1%L-谷氨酰胺(200mmol/L)Gibco。 1.2.1.3 其他细胞磷酸缓冲液(PBS)Gibco;0.4%台盼蓝Solarbio,0.25%胰蛋白酶Gibco。 1.2.2 影响EGCG氧化聚合的环境因素分析1.2.2.1 溶液环境对EGCG聚合的影响实验选择了H2O、RPMll640、DMEM(pH=7)三种溶液体系,分别加入不同浓度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L),置于37℃培养箱恒温反应24h后,吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中,检测578nm的OD值,以确定溶液体系对EGCG氧化聚合的影响。 1.2.2.2 温度环境对EGCG聚合的影响实验以RPMll640(pH=7)为溶液体系,分别加入不同浓度的EGCG(0、20、40、80、320μmol/L),置于37℃培养箱和74℃的水浴锅中恒温反应24h后,吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中,检测578nm的OD值,以确定温度对EGCG氧化聚合的影响。 1.2.2.3 时间对EGCG聚合的影响实验以RPMI1640(pH=7)为溶液体系,加入320μmol/L的EGCG,置于37℃培养箱恒温反应3、6、12、24h后,各组吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中,检测578nm的OD值,以确定时问对EGCG氧化聚合的影响。 1.2.2.4 pH对EGCG聚合的影响实验选用RPMI1640和H20为两种溶液体系,分别设置不同的pH(pH=5和9),加入不同浓度的EGCG(0、20、80、320μmol/L),分别置于37℃培养箱中恒温处理24h后,各组吸取三个重复的150μL溶液置于96孔板中,检测578nm的OD值,以确定pH对EGCG氧化聚合的影响。 1.2.3 EGCG在培养系统中对NCM460细胞的胞内、外H202浓度影响接种6个含NCM460的6孔培养板,待细胞贴壁生长后,更换含有不同浓度EGCG(0、20、40、80μmol/L)的RPMll640培养液,每个6孔板培养时间分别为l、2、3、6、12、24h,在对应的时间节点先取各孔上层培养液50μL,用于胞外H202浓度检测。之后,弁去含EGCG培养基,胰酶消化后用1mLRPMI1640培养基吹打混匀形成细胞悬液,计数,吸取5×105个细胞,用于胞内H202浓度检测。 1.2.4 H202浓度检测按照过氧化氢检测试剂盒操作步骤,检测小同浓度EGCG处理各时间点的培养上清及细胞内H202浓度。 1.3 统计学分析实验均重复三次,对数据进行整理归纳,利用SPSS17.0统计软件进行单凶素方差分析,采用GrahPadPrism5制图软件作图分析。 声明:本文所用图片、文字来源《食品工业科技》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系 相关链接:L-谷氨酰胺,胰蛋白酶,儿茶素,表没食子儿茶素没食子酸酯 |
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